Загадочная улыбка далеко не единственная тайна «Моны Лизы». Долгие годы искусствоведы не могли прийти к мнению, кто именно изображен на картине.  

Согласно Джорджо Вазари (1511—1574), автору биографий итальянских художников, который написал о Леонардо в 1550 году, 31 год спустя после его смерти, Мона Лиза (сокр. от мадонна Лиза) была женой флорентийца по имени Франческо дель Джокондо (итал. Francesco del Giocondo), на чей портрет Леонардо потратил 4 года.

 «Взялся Леонардо выполнить для Франческо дель Джокондо портрет моны Лизы, жены его, и, потрудившись над ним четыре года, оставил его недовершенным. Это произведение находится ныне у французского короля в Фонтенбло. Это изображение всякому, кто хотел бы видеть, до какой степени искусство может подражать природе, даёт возможность постичь это наилегчайшим образом, ибо в нём воспроизведены все мельчайшие подробности, какие только может передать тонкость живописи. Поэтому глаза имеют тот блеск и ту влажность, какие обычно видны у живого человека, а вокруг них переданы все те красноватые отсветы и волоски, которые поддаются изображению лишь при величайшей тонкости мастерства. Ресницы, сделанные наподобие того как, действительно растут на теле волосы, где гуще, а где реже, и расположенные соответственно порам кожи, не могли бы быть изображены с большей естественностью. Нос со своими прелестными отверстиями, розоватыми и нежными, кажется живым. Рот, слегка приоткрытый, с краями, соединёнными алостью губ, с телесностью своего вида, кажется не красками, а настоящей плотью. В углублении шеи при внимательном взгляде можно видеть биение пульса. И поистине можно сказать, что это произведение было написано так, что повергает в смятение и страх любого самонадеянного художника, кто бы он ни был.
Между прочим, Леонардо прибег к следующему приёму: так как мона Лиза была очень красива, то во время писания портрета он держал людей, которые играли на лире или пели, и тут постоянно были шуты, поддерживавшие в ней веселость и удалявшие меланхолию, которую обычно сообщает живопись выполняемым портретам. У Леонардо же в этом произведении улыбка дана столь приятной, что кажется, будто бы созерцаешь скорее божественное, нежели человеческое существо; самый же портрет почитается произведением необычайным, ибо и сама жизнь не могла бы быть иной».

 Улыбка Моны Лизы является одной из самых знаменитых загадок картины. Эта лёгкая блуждающая улыбка встречается во многих произведениях как самого мастера, так и у леонардесков, но именно в «Моне Лизе» она достигла своего совершенства. 

Следует, впрочем, отметить, что первым это определение (или даже литературный штамп) ввел писатель-романтик Теофиль Готье лишь в 1855 году. Он «…сделал главное — он придумал загадочную улыбку Джоконды. До него никто не видел в ней никакой тайны. Вазари, например, называл улыбку Моны Лизы всего лишь „приятной “. Готье представил улыбку Джоконды как главное оружие женщины-вамп, в которую опасно влюбляться, но не влюбиться нельзя».

Готье писал: «Джоконда! Это слово немедленно вызывает в памяти сфинкса красоты, который так загадочно улыбается с картины Леонардо… Опасно попасть под обаяние этого призрака… Ее улыбка обещает неизвестные наслаждения, она так божественно иронична… Если бы Дон Жуан встретил Джоконду, он бы узнал в ней все три тысячи женщин из своего списка…»

После Готье, пишет искусствовед Г. Козлов, загадочная улыбка превратилась для публики в главное достоинство «Джоконды», затмив даже авторство самого Леонардо. 

Искусствоведы и историки искусства посвятили ей немало строк. Так, Гращенков пишет: «Бесконечное многообразие человеческих чувств и желаний, противоборствующих страстей и помыслов, сглаженных и слитых воедино, отзывается в гармонически бесстрастном облике Джоконды лишь неопределённостью её улыбки, едва зарождающейся и пропадающей. Это ничего не означающее мимолётное движение уголков её рта, словно отдалённое, слившееся в один звук эхо, доносит до нас из беспредельной дали красочную полифонию духовной жизни человека». 

Искусствовед Ротенберг считает, что «немного найдется во всем мировом искусстве портретов, равных „Моне Лизе “по силе выражения человеческой личности, воплощенной в единстве характера и интеллекта. Именно необычайная интеллектуальная заряженность леонардовского портрета отличает его от портретных образов кватроченто. Эта его особенность воспринимается тем острее, что она относится к женскому портрету, в котором характер модели прежде раскрывался в совершенно иной, преимущественно лирической образной тональности. Исходящее от „Моны Лизы “ощущение силы — это органическое сочетание внутренней собранности и чувства личной свободы, духовная гармония человека, опирающегося на его сознание собственной значительности. И сама улыбка её отнюдь не выражает превосходства или пренебрежения; она воспринимается как результат спокойной уверенности в себе и полноты самообладания». 

Искусствовед Борис Виппер указывает, что отсутствие по моде того времени бровей и выбритый лоб, быть может, невольно усиливает странную загадочность в выражении её лица. Далее он пишет о силе воздействия картины: «Если мы спросим себя, в чём заключается великая притягательная сила „Моны Лизы “, её действительно ни с чем не сравнимое гипнотическое воздействие, то ответ может быть только один — в её одухотворенности. В улыбку „Джоконды “вкладывали самые хитроумные и самые противоположные интерпретации. В ней хотели читать гордость и нежность, чувственность и кокетство, жестокость и скромность. Ошибка заключалась, во-первых, в том, что искали во что бы то ни стало индивидуальных, субъективных душевных свойств в образе Моны Лизы, тогда как несомненно, что Леонардо добивался именно типической одухотворенности. Во-вторых, — и это, пожалуй, ещё важнее — одухотворенности Моны Лизы пытались приписать эмоциональное содержание, между тем как на самом деле она имеет интеллектуальные корни. Чудо Моны Лизы заключается именно в том, что она мыслит; что, находясь перед пожелтевшей, потрескавшейся доской, мы непреоборимо ощущаем присутствие существа, наделенного разумом, существа, с которым можно говорить и от которого можно ждать ответа». 

Лазарев анализировал её как учёный-искусствовед: «Эта улыбка является не столько индивидуальной чертой Моны Лизы, сколько типической формулой психологического оживления, формулой, проходящей красной нитью через все юношеские образы Леонардо, формулой, которая позднее превратилась, в руках его учеников и последователей, в традиционный штамп. Подобно пропорциям леонардовских фигур, она построена на тончайших математических измерениях, на строгом учете выразительных ценностей отдельных частей лица. И при всем том, эта улыбка абсолютно естественна, и в этом именно сила её очарования. Она отнимает у лица все жесткое, напряжённое, застылое, она превращает его в зеркало смутных, неопределённых душевных переживаний, в своей неуловимой легкости она может быть сравнена лишь с пробегающей по воде зыбью». 

Её анализ привлекал внимание не только искусствоведов, но и психологов. Зигмунд Фрейд пишет: «Кто представляет картины Леонардо, у того всплывает воспоминание о странной, пленительной и загадочной улыбке, затаившейся на губах его женских образов. Улыбка, застывшая на вытянутых, трепетных губах, стала характерной для него и чаще всего называется „леонардовской“. В своеобразно прекрасном облике флорентийки Моны Лизы дель Джоконды она сильнее всего захватывает и повергает в замешательство зрителя. Эта улыбка требовала одного толкования, а нашла самые разнообразные, из которых ни одно не удовлетворяет. (…) Догадка, что в улыбке Моны Лизы соединились два различных элемента, рождалась у многих критиков. Поэтому в выражении лица прекрасной флорентийки они усматривали самое совершенное изображение антагонизма, управляющего любовной жизнью женщины, сдержанности и обольщения, жертвенной нежности и безоглядно-требовательной чувственности, поглощающей мужчину как нечто постороннее. (…) Леонардо в лице Моны Лизы удалось воспроизвести двоякий смысл её улыбки, обещание безграничной нежности и зловещей угрозы».  

Особенно завораживает зрителя демоническая обворожительность этой улыбки. Сотни поэтов и писателей писали об этой женщине, которая кажется то обольстительно улыбающейся, то застывшей, холодно и бездушно смотрящей в пространство, и никто не разгадал ее улыбку, никто не истолковал ее мысли. Все, даже пейзаж, таинственны, подобно сновидению, трепетны, как предгрозовое марево чувственности (Мутер). 

Философ А. Ф. Лосев пишет о ней резко негативно: …"Мона Лиза" с её «бесовской улыбочкой». «Ведь стоит только всмотреться в глаза Джоконды, как можно без труда заметить, что она, собственно говоря, совсем не улыбается. Это не улыбка, но хищная физиономия с холодными глазами и отчётливым знанием беспомощности той жертвы, которой Джоконда хочет овладеть и в которой, кроме слабости, она рассчитывает ещё на бессилие перед овладевшим ею скверным чувством». 

Открыватель термина микровыражение психолог Пол Экман пишет о выражении лица Джоконды, анализируя его с точки зрения своих знаний о человеческой мимике: «два других вида [улыбок] сочетают искреннюю улыбку с характерным выражением глаз. Флиртующая улыбка, хотя при этом соблазнитель и отводит глаза в сторону от объекта своего интереса, чтобы затем вновь бросить на него лукавый взгляд, который опять же мгновенно отводится, едва лишь будет замечен. Необычность впечатления от знаменитой Моны Лизы отчасти и заключается в том, что Леонардо ловит свою натуру именно в момент этого игривого движения; повернув голову в одну сторону, она смотрит в другую — на предмет своего интереса. В жизни это выражение лица мимолётно — взгляд украдкой длится не более мгновения».